Перейти к:
Мембраноатакующий комплекс как показатель гиперактивации комплемента при сахарном диабете 2 типа
Аннотация
Анализ уровней конечного продукта активации системы комплемента - мембраноатакующего комплекса (MAK), а также гемо-литических активностей C1 и C3 компонентов комплемента в крови больных сахарным диабетом 2 типа (СД2) и здоровых лиц.
Материалы и методы.
Субъектами исследования являлись 37 больных СД2 (женщин - 20, мужчин - 17; средний возраст - 58?9 лет(М?d)) и 37 здоровых лиц без наследственной отягощенности сахарным диабетом (женщин - 20, мужчин - 17, средний возраст -52?12 лет (М?d)). Определение уровней МАК в образцах сыворотки крови субъектов исследования проводили методом твердофазногоиммуноферментного анализа (ELISA). При определении гемолитических активностей C1 и C3 компонентов комплемента в качествесубстрата использовали эритроциты барана, сенсибилизированные кроличьими антителами, и дефицитные по этим компонентамсыворотки.
Результаты.
Согласно полученным данным, у больных СД2 средние значения всех вышеотмеченных параметров достоверно превышалитаковые у здоровых лиц.
Заключение.
Полученные данные свидетельствуют, что патогенез СД2 характеризуется гиперактивацией системы комплемента,включая классический и терминальный каскад, и гиперпродукцией его цитотоксических продуктов.
Для цитирования:
Аракелова Э.А., Овсепян М.Р., Бояджян А.С., Аракелян А.А., Геворкян А.А., Мамиконян А.А. Мембраноатакующий комплекс как показатель гиперактивации комплемента при сахарном диабете 2 типа. Сахарный диабет. 2011;14(3):17-20.
For citation:
Arakelova E.A., Ovsepyan M.R., Boyadzhyan A.S., Arakelyan A.A., Gevorkyan A.A., Mamikonyan A.A. The membrane attack complex as an indicator of complement hyperactivation in type 2 diabetes mellitus. Diabetes mellitus. 2011;14(3):17-20. (In Russ.)
Система комплемента активируется в каскаде протеолитических реакций и состоит из более чем 60 растворимых и мембраносвязанных белков, включая рецепторы и регуляторы. Существуют три пути активации комплемента – классический, альтернативный и лектиновый, отличающиеся составом компонентов и пусковыми механизмами. Конечный этап, так называемый терминальный каскад комплемента, идентичен для всех трех путей. Этот каскад запускается расщеплением С3 компоненты комплемента на активные фрагменты под действием C3-конвертазы (продукта активации всех трех путей) и приводит к формированию мембраноатакующего комплекса (С5b-9; МАК) или конечного продукта активации комплемента. Встраиваясь в плазматическую мембрану, МАК приводит к ее перфорации и лизису клетки. МАК может также выступать триггером апоптоза, инициировать продукцию клетками медиаторов воспаления, цитокинов, простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов, активных форм кислорода и экспрессию адгезивных молекул [1–6].
Нарушения иммунного статуса организма вносят существенный вклад в патогенез обоих типов сахарного диабета (СД) [7–9]. Хорошо известно, что преждевременная инвалидность и смертность больных СД 2 типа (СД2) в первую очередь связана с его макроваскулярными осложнениями (атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, острый инфаркт миокарда, инсульт, гангрена нижних конечностей и пр.), индуцирующими развитие воспалительных реакций [10, 11]. C другой стороны, гиперактивация иммунного ответа организма, индуцируемая окислительным стрессом или рядом других факторов, приводит к дисфункции инсулинпродуцирующих бета-клеток и инсулинорезистентности [12, 13], способствуя развитию СД2.
В связи с вышеизложенным, представляется интересным изучение функционального состояния системы комплемента при СД2. Результаты наших предыдущих исследований свидетельствуют о значительном повышении в крови больных СД2 активности классического и альтернативного каскадов комплемента [14]. В настоящей работе мы провели сравнительный анализ уровней МАК, а также гемолитической активности C1 и C3 компонентов комплемента в крови больных вышеотмеченным заболеванием. В исследование были также включены здоровые лица (ЗЛ) в качестве контроля.
Методы
Субъектами исследования являлись 37 больных СД2 (женщин – 20, мужчин – 17; средний возраст – 58±9 лет (М±d)) и 37 здоровых лиц без наследственной отягощенности СД (женщин – 20, мужчин – 17, средний возраст – 52±12 лет (М±d)). Больные состояли на учете в Научно-медицинском центре «Армения» МЗ РА. Диагностирование пациентов проводили врачи вышеуказанного учреждения согласно Международной классификации болезней (10 издание, МКБ-10). Средняя длительность заболевания диабетом у больных СД2 составляла 11±7 лет (М±d). У всех больных СД2 наблюдалось тяжелое течение заболевания, сопровождающееся осложнениями, характерными для поздних этапов развития диабета (макроангио-, микроангио- и нейропатии). Группу ЗЛ (без наследственной отягощенности инсультом, инфарктом миокарда и СД) добровольно составили сотрудники НАН РА. Никто из субъектов исследования не страдал онкологическими или аутоиммунными заболеваниями, не переносил инсульт или инфаркт миокарда, острых инфекционных заболеваний, не подвергался хирургическим операциям и не принимал препараты иммуномодуляторного действия как минимум за 12 месяцев до проведения настоящего исследования. Взятие крови было проведено с согласия больных или их близких, а также с разрешения Комитета по этике Института молекулярной биологии НАН РА.
Забор крови проводили в 9:00 часов натощак пункцией из локтевой вены. Пробы сразу помещали в лед, затем центрифугировали при 3000g в течение 10 минут и отбирали сыворотку, которую использовали в последующих экспериментах. Образцы сыворотки хранили при -30°C.
Определение уровней МАК в образцах сыворотки крови субъектов исследования проводили ранее описанным нами методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) [15]. В качестве связывающих антител были использованы мышиные моноклональные антитела, специфичные к неоэпитопам С9 компоненты МАК, экспонированной на поверхности еще не включенных в мембраны водорастворимых МАК. Связанные с антителами МАК обнаруживали при использовании кроличьих антител (конъюгированных с пероксидазой хрена), полиспецифичных к другой компоненте МАК – белку S, и о-фенилендиамин дигидрохлорида (в 3% перекиси водорода) в качестве субстрата. Измерения проводили при использовании прибора «Stat Fax 3200» (Awareness Technology Inc., USA) на микропланшетах с 96 ячейками, при длине волны 492 нм. Калибровку проводили при использовании стандартной сыворотки с известной концентрацией МАК. Концентрацию МАК выражали в микрограммах на 1 мл сыворотки (мкг/мл).
Гемолитическую активность C1 и C3 компонентов комплемента определяли ранее описанным методом при использовании эритроцитов барана, сенсибилизированных кроличьими антителами в качестве субстрата и дефицитных по этим компонентам сывороток [16]. C1-дефицитную сыворотку получали аффинной хроматографией сыворотки крови человека как описано ранее [17]. С3-дефицитную сыворотку получали обработкой сыворотки крови морской свинки зимосаном ранее описанным методом [18]. Активность выражали в процентах лизировавших эритроцитов (% лизиса). Долю лизированных эритроцитов определяли с учетом их спонтанного лизиса (контроль) и рассчитывали по отношению к 100% лизису (положительный контроль). Измерения проводили при длине волны 414 нм на спектрофотометре CE-292 (Cesil Instruments Ltd., UK).
Статистическую обработку полученных данных, включающую непараметрический U-тест Манна–Уитни, проводили используя программный пакет «SPSS-13». Значения p<0,05 были приняты как статистически достоверные.
Результаты и обсуждение
В результате проведенных исследований было установлено, что уровни МАК в крови больных СД2 в среднем в 1,6 раза достоверно превышают уровни МАК в крови ЗЛ. Уровни C1 и С3 компонентов комплемента в крови больных СД2 в среднем в 2,2 раза превышали аналогичные параметры ЗЛ. Результаты статистического анализа полученных данных представлены в таблице 1.
C1q является начальным звеном классического каскада комплемента, C3 является начальным звеном альтернативного каскада комплемента и, одновременно, как уже было отмечено, мишенью C3-конвертазы, запускающей терминальный каскад комплемента [1–6]. Полученные нами данные подтверждают результаты наших предыдущих экспериментов, свидетельствующих о гиперактивации альтернативного и классического каскадов комплемента при СД2, а кроме того, представляют убедительные доказательства гиперактивации терминального каскада комплемента при отмеченном заболевании. Наши данные находятся в соответствии с результатами ранее опубликованных иммуногистохимических исследований, выявивших накопление промежуточного и конечного продуктов активации комплемента C3d и МАК, соответственно, на стенках эндоневральных микрососудов и микрососудов сетчатки у больных СД [19, 20].
Таким образом, очевидно, что при СД2, на этапе поздних осложнений происходит гиперактивация системы комплемента, включая его альтернативный, классический и терминальный каскады, и гиперпродукция его цитотоксических продуктов.
Гиперактивность системы комплемента при СД2 может быть обусловлена комплексом гормонально-метаболических и генетических нарушений, наблюдающихся при данной патологии [21–23]. С другой стороны, накопление продуктов активации системы комплемента может в значительной степени способствовать дальнейшему прогрессированию заболевания.
В основе хронических осложнений СД2 лежит повреждение стенок микрососудов, а также нарушение тромбоцитарно-сосудистого и гуморального звеньев системы гемостаза [11, 24]. Это меняет их антигенные и функциональные характеристики, вызывает нарушение проницаемости и прочности стенки сосуда, развитие в ней иммунопатологических реакций, сужение просвета сосудов и уменьшение площади их внутренней поверхности, развитие отека, сужение просвета микрососудов и углубление в них дистрофических процессов [11, 24]. Очевидно, что наряду с другими факторами, сверхпродукция хемотоксинов, опсонинов, анафилатоксинов и МАК в результате гиперактивации системы комплемента может в значительной степени способствовать прогрессированию отмеченных патологических изменений.
Так, например, вопрос о причинной взаимосвязи между уровнем гликемии и риском развития хронических осложнений при СД2 получил свое реальное клиническое выражение в соотношении уровня компенсации углеводного обмена и частоты развития микро- и макроангиопатий. Показано, что риск развития сосудистой патологии при СД2 значительно возрастает даже при незначительном повышении (на 1%) уровня гликированного гемоглобина [25]. В этой связи интересно отметить, что помимо цитотоксических эффектов, встраивание МАК в мембраны клеток сосудистого эндотелия приводит к высвобождению факторов роста, стимулирующих пролиферацию клеток, способных также при длительном воздействии индуцировать гипертрофию и тромбогенную трансформацию сосудистой стенки [1–6]. В норме продукция МАК, даже в условиях гиперактивации системы комплемента, находится под контролем регуляторного белка CD59, способного препятствовать формированию МАК в процессе активации комплемента [26, 27]. Однако, как свидетельствуют экспериментальные данные, в гликированном состоянии CD59 теряет способность ингибировать образование МАК [28–30]. Это факт представляет непосредственный интерес в свете полученных нами данных, поскольку, как известно, для патогенеза СД2 характерны повышение пролиферации гладкомышечных клеток сосудов и ретинальных эндотелиальных клеток и, как результат, гипертрофия и тромбогенная трансформация сосудистой стенки, приводящие к нарушению проницаемости сосудов и ангиопатиям [11, 24].
Кроме того, показано, что, как свидетельствуют клинические и экспериментальные данные, для СД2 характерна интенсификация апоптоза в нейрональной и сосудистой ткани, стимулирующая развитие ретинопатии [31, 32]. В этой связи и основываясь на полученных нами данных, не исключено, что определенный вклад в этот процесс вносят продукты протеолитической активации С3 и С4 компонентов комплемента (C3b, C4b, iC3b и C3dg), являющиеся известными триггерами апоптоза [1–6].
Таким образом, основываясь на полученных нами и вышеприведенных данных, можно заключить, что один из механизмов развития сосудистых осложнений СД2, индуцируемых, в частности, гипергликемией, может заключаться в гликировании ингибитора МАК и переводе его в неактивное состояние.
С другой стороны, вышеописанные патологические изменения в сосудистой ткани, а также множество других метаболических и гормональных нарушений, характерных для СД2, могут, в свою очередь, активировать систему комплемента, приводя к накоплению физиологически активных продуктов протеолиза компонентов комплемента (медиаторов воспаления, триггеров апоптоза и факторов, повышающих проницаемость сосудов), способствующих дальнейшему прогрессированию осложнений СД2.
Список литературы
1. Volankis J.E., Frank M.M. The human complement system in health and disease // Mircel Dekker. - Inc, New York, 1998.
2. Sakamoto M., Fujisawa Y., Nishioka K. Physiologic role of the complement system in host defense, disease, and malnutrition // Nutrition. - 1998. - V. 14 (4). - P. 391-398.
3. Sim R.B., Laich A. Serine proteases of the complement system // BiochemSoc. Trans. - 2000. - V. 28 (5). - P. 545-550.
4. Mollnes T.E., Song W.C., Lambris J.D. Complement in inflammatory tissue damage and disease // Trends Immunol. Today. - 2002. - V. 23 (2). - P. 61-66.
5. Cole D.S., Morgan B.P. Beyond lysis: how complement influences cell fate // Clin. Sci. - 2003. - V.104 (5). - P. 455-466.
6. Nauta A.J., Roos A., Daha M.R. A regulatory role for complement in innate immunity and autoimmunity // Int. Arch. Allergy Immunol. - 2004. - V. 134 (4). - P. 310-323.
7. Handwerger B.S., Fernandes G., Brown D.M. Immune and autoimmune aspects of diabetes mellitus // Hum. Pathol. - 1980. - V. 11 (4). - P. 338-352.
8. Pino S.C., Kruger A.J., Bortell R. The role of innate immune pathways in type 1 diabetes pathogenesis // Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. - 2010. - V. 17 (2). - P. 126-130.
9. Donath M.Y., Shoelson S.E. Type 2 diabetes as an inflammatory disease // Nat. Rev. Immunol. - 2011. - V.11 (2). - P. 98-107. 10. Bariş N., Erdoğan M., Sezer E., Saygili F., Mert Ozgönül A., Turgan N.,
10. Ersöz B. Alterations in L-arginine and inflammatory markers in type 2 diabetic patients with and without microalbuminuria // Acta Diabetol. - 2009. - V. 46 (4). - P. 309-316.
11. Huysman E., Mathieu C. Diabetes and peripheral vascular disease // Acta Chir. Belg. - 2009. - V. 109 (5). - P. 587-594.
12. Kaneto H., Matsuoka T.A., Nakatani Y., Kawamori D., Miyatsuka T., Matsuhisa M., Yamasaki Y. Oxidative stress, ER stress, and the JNK pathway in type 2 diabetes // J. Mol. Med. - 2005. - V.83 (6). - P. 429-439.
13. Solinas G., Vilcu C., Neels J.G., Bandyopadhyay G.K., Luo J.L., Naugler W., Grivennikov S., Wynshaw-Boris A., Scadeng M., Olefsky J.M., Karin M. JNK1 in hematopoietically derived cells contributes to dietinduced inflammation and insulin resistance without affecting obesity // Cell Metab. - 2007. - V. 6 (5). - P. 386-397.
14. Овсепян М.Р., Бояджян А.С., Оганесян Л.П., Maмиконян A.A., Геворкян A.A. Активация системы комплемента по классическому и альтернативному пути при длительном течении сахарного диабета 2-готипа // Проблемы эндокринологии (Москва). - 2006 (6). - С. 14-17.
15. Morgan B.P., Daniels R.H., Williams B.D. Measurement of terminal complement complexes in rheumatoid arthritis // Clin. Exp. Immunol. - 1988. - V. 73. - P. 473-478.
16. Watford W.T., Ghio A.J., Wright J.R. Complement-mediated host defense in the lung // Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. - 2000. - V. 279 (5). - P. 790-798.
17. Daha M.R. Purification of complement component / In Doods, A.W. and Sim, R.B. eds: Complement. A practical approach. Oxford University press, Oxford. - 1997. - P. 121-133.
18. Morgan B.P. Measurement of complement hemolytic activity, generation of complement-depleted sera, and production of hemolytic intermediates / In: Morgan, B.P. ed. Methods in molecular biology. Complement methods and protocols. Humana Press, Totowa, New Jersey. - 2000. - V. 150. - P. 61-71.
19. Rosoklija G.B., Dwork A.J., Younger D.S., Karlikaya G., Latov N., Hays A.P. Local activation of the complement system in endoneurial microvessels of diabetic neuropathy // Acta Neuropathol. - 2000. - V. 99 (1). - P. 55-62.
20. Gerl V.B., Bohl J., Pitz S., Stoffelns B., Pfeiffer N., Bhakdi S. Extensive deposits of complement C3d and C5b-9 in the choriocapillaris of eyes of patients with diabetic retinopathy // Invest Ophthalmol Vis Sci. - 2002. - V.43 (4). - P. 1104-1108.
21. Галстян Г.Р. Метаболические нарушения при сахарном диабете 2 типа и методы их коррекции // Русский медицинский журнал. - 2001. - Т. 9 (24). - С. 1098-1100.
22. DeFronzo R.A. Pathogenesis of type 2 diabetes mellitus // Med. Clin. N. Am. - 2004. - V. 88. - P. 787-835.
23. Ahlqvist E., Ahluwalia T.S., Groop L. Genetics of type 2 diabetes // Clin. Chem. - 2011. - V. 57 (2). - P. 241-254.
24. McMillan D.E. Development of vascular complications in diabetes // Vasc. Med. - 1997. - V. 2 (2). - P. 132-142.
25. UKPDS Group. Intensive blood glucose control with sulphonylureasor insulin compared with conventional treatment and risk of complications in patients with type 2 diabetes // Lancet. - 1998. - V. 352. - P. 837-853.
26. Acosta J., Qin X., Halperin J. Complement and complement regulatory proteins as potential molecular targets for vascular diseases // Curr. Pharm. - 2004. - V. 10 (2). - P. 203-211.
27. Huang Y., Smith C.A., Song H., Morgan B.P., Abagyan R. Tomlinson S. Insights into the human CD59 complement binding interface toward engineering new therapeutics // J. Biol. Chem. - 2005. - V. 280 (40). - P. 34073-34079.
28. Acosta J., Hettinga J., Fluckiger R., Krumrei N., Goldfine A., Angarita L., Halperin J. Molecular basis for a link between complement and the vascular complications of diabetes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2000. - V. 97 (10). - 5450-5455.
29. Qin X., Goldfine A., Krumrei N., Grubissich L., Acosta J., Chorev M., Hays A.P., Halperin J.A. Glycation inactivation of the complement regulatory protein CD59. A possible role in the pathogenesis of the vascular complications of human diabetes // Diabetes. - 2004. - V. 53. - P. 2653-2661.
30. Cheng Y., Gao M. The effect of glycation of CD59 on complementmediated cytolysis // Cell. Mol. Immunol. - 2005. - V. 2 (4). - P. 313-317.
31. Barber A.J., Gardner T.W., Abcouwer S.F. The significance of vascular and neural apoptosis to the pathology of diabetic retinopathy // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2011. - V. 52 (2). - P. 1156-1163.
32. Park S.H., Park J.W., Park S.J., Kim K.Y., Chung J.W., Chun M.H., Oh S.J. Apoptotic death of photoreceptors in the streptozotocin-induced diabetic rat retina // Diabetologia. - 2003. - V. 46 (9). - P. 1260-1268.
Об авторах
Элина Александровна АракеловаМери Робертовна Овсепян
Анна Суреновна Бояджян
Арсен Арташесович Аракелян
Астхик Артавазовна Геворкян
Ашот Андреевич Мамиконян
Рецензия
Для цитирования:
Аракелова Э.А., Овсепян М.Р., Бояджян А.С., Аракелян А.А., Геворкян А.А., Мамиконян А.А. Мембраноатакующий комплекс как показатель гиперактивации комплемента при сахарном диабете 2 типа. Сахарный диабет. 2011;14(3):17-20.
For citation:
Arakelova E.A., Ovsepyan M.R., Boyadzhyan A.S., Arakelyan A.A., Gevorkyan A.A., Mamikonyan A.A. The membrane attack complex as an indicator of complement hyperactivation in type 2 diabetes mellitus. Diabetes mellitus. 2011;14(3):17-20. (In Russ.)