Аллельные варианты генов HLA класса II DRB1 и DQB1 и риск развития сахарного диабета 1 типа у жителей Башкортостана

Сахарный диабет 1 типа (СД1) представляет собой заболевание эндокринной системы, при котором наблюдается хроническое повышение уровня глюкозы в крови. В основе патогенеза СД1 лежит абсолютная недостаточность секреции инсулина, что сопровождается расстройством всех видов обмена веществ, нарушениями гуморального и клеточного иммунитета, развитием тяжелых сосудистых осложнений. В вопросах этиологии и патогенеза СД1 остается много неясных аспектов. 

Заболеваемость СД1 варьирует в различных странах, а также в различных этнических группах даже в пределах одной страны. По состоянию на 01.01.2010 г. в России было зарегистрировано 294 256 больных СД1. Распространенность СД1 с 2000 по 2009 гг. у детей выросла на 35,7%, у подростков на 68,9%, у взрослых на 2,36%. 

Социальная, экономическая значимость заболевания взаимосвязана с его хроническими осложнениями. По данным федерального регистра, частота диабетичес­кой ретинопатии среди взрослых больных с СД1 составила 53%, нефропатии – 50%, синдрома диабетической стопы – 5% (2010 г.). 

СД1 является многофакторным полигенным заболеванием, развитие которого обусловлено сложным взаимодействием генетических и средовых факторов. Поиск генов, предрасполагающих к СД1, важен в плане раскрытия механизмов развития заболевания и для разработки ранней доклинической диагностики, профилактики заболевания и медико-генетического консультирования. 

В первой работе по полному геномному поиску, проведенной в Великобритании, было обнаружено 20 локусов предрасположенности к СД1 на разных хромосомах, которые обозначили акронимом IDDM (англ. insulin-dependent diabetes mellitus – инсулинзависимый СД) и пронумеровали [1]. Авторы подчеркивают, что в наследовании СД1 приоритетным является локус IDDM1, соотнесенный с генами главного комплекса гистосовмес­тимости на коротком плече хромосомы 6 (HLA). 

Данные анализа сцепления локусов предрасположенности к СД1, проведенные в разных странах, порой противоречивы. Например, не обнаружено сцепления локусов IDDM5, IDDM8, IDDM15 с СД1 у басков (народ, населяющий север Испании и юго-запад Франции) [2].

IDDM1 является «универсальным» локусом гене­ти­чес­кой предрасположенности к СД1, сцепление с которым обнаружено во всех изученных популяциях. С ним связано до 40% генетической предрасположенности к СД1. В различных этнических группах предрасположенность к этому заболеванию сочетается с различными аллелями генов HLA [3–4]. Неоднократно было показано, что степень риска СД1 определяется комбинацией DRB1, DQA1, DQB1 аллелей [5].

Согласно результатам полногеномных исследований, всего в развитии СД1 играют роль 22 локуса, главным образом HLA, INS, CTLA4, PTPN22, IL2RA, IFIH1, CLEC16A, 12q13, C12orf30, PTPN2, IL2-IL21, UBASH3A, BACH2, PRKCQ, CTSH, C1QTNF6 [6–8]. 

Молекулярно-генетические исследования СД1 выполнены на ограниченном числе популяций. Существует настоятельная необходимость проведения дальнейших исследований для подтверждения значимости полиморфизма этих генов в формировании предрасположенности к СД1 в популяциях разных народов мира, в том числе проживающих в Российской Федерации. 

В России проведен ряд исследований, направленных на выявление аллелей, предрасполагающих к СД1, в различных этнических группах, в том числе среди народов Башкортостана [9–13]. Вместе с тем, недостаточно освещен вопрос взаимодействия различных HLA-аллелей в определении риска СД1 среди народов, проживающих в Республике Башкортостан.

Цель

Изучить значимость сочетаний аллельных вариантов генов HLA класса II DRB1 и DQB1 в развитии СД1 у жителей Республики Башкортостан разной этнической принадлежности (русских, татар, башкир).

Материалы и методы

Материалом исследования служили образцы ДНК мужчин и женщин, русских, татар и башкир по этничес­кой принадлежности. Обследовано 323 пациента с диагнозом СД1 в возрасте 10–55 лет. В контрольную группу вошли 683 практически здоровых индивида в возрасте 15–57 лет, не родственных между собой, без клинических симптомов СД1 и наследственной отягощенности по изуча­емому заболеванию. Всеми пациентами подписано информированное согласие.

ДНК выделяли из цельной венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции. Типирование генов DRB1 и DQB1 проводили методом мультипраймерной полимеразной цепной реакции («ДНК-Технология»). Продукты амплификации идентифицировали при помощи электрофореза в 1% агарозном геле с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и визуализацией в ультрафиолетовом свете с помощью гель-видеодокументирующей системы (Vilber Lormat, Франция).

Статистическая обработка проводилась с использованием программ Statistica for Windows v. 6.0, MS Excel’98 (Мicrosoft) и RxS (RowsxColumns) [14]. Рассчитывали средние значения исследуемых величин, их стандартные отклонения, ошибку среднего и 95% доверительный интервал. Частоты генотипов и аллелей сравнивали с использованием точного двустороннего критерия Фишера (Р). Кроме того, применяли поправку Бонферрони на множественность сравнений (Р’). Относительный риск заболевания (OR) вычисляли по формуле J.M. Bland (2000) [15].

Результаты и обсуждение

Анализ ассоциаций аллельных вариантов гена DRB1 с СД1. 

В группе больных СД1, башкир по этнической принадлежности, по сравнению с контрольной выборкой чаще обнаруживаются аллели DRB1*04 (P’=0,006) и DRB1*17 (P’=0,006), а также генотип DRB1*04/*17 (P’=0,024). Это позволяет считать их маркерами повышенного риска заболевания (OR=4,69, OR=3,32, OR=11,13 соответственно). Аллель DRB1*15 выявлен среди больных в меньшем числе случаев, чем среди здоровых лиц (P’=0,042). Показатель соотношения шансов (OR=0,14) свидетельствует о пониженном риске СД1 по данному аллелю. 

У больных СД1, русских по этнической принадлежности, в большем числе случаев, чем у здоровых лиц той же этнической принадлежности, обнаруживаются аллели DRB1*04 (P’=0,006), DRB1*17 (P’=0,006) и генотип DRB1*04/*17 (P’=0,006). Следовательно, их можно рассматривать как маркеры повышенного риска заболевания (OR=4,05, OR=3,15, OR=9,79 соответственно). В выборке больных также ниже частота аллелей DRB1*11 (P’=0,042) и DRB1*15 (P’=0,042). По данным аллельным вариантам OR составляет соответственно 0,24 и 0,03, что позволяет считать их протективными. 

Оценка частот аллелей и генотипов гена DRB1 в выборке, сформированной из индивидов татарской этнической принадлежности, показала следующее. Среди больных СД1 по сравнению со здоровыми лицами повышена частота аллелей DRB1*04 (P’=0,028), DRB1*17 (P’=0,014) и генотипа DRB1*04/*17 (P’=0,022). Это позволяет считать их предрасполагающими к заболеванию (OR=2,25, OR=2,42, OR=20,18 соответственно). 

Аллели DRB1*01 (P’=0,006) и DRB1*15 (P’=0,006) обнаружены в группе больных с меньшей частотой, чем в выборке здоровых лиц, маркируя пониженный риск заболевания (OR=0,34, OR=0,03 соответственно). 

Анализ ассоциаций аллельных вариантов гена DQB1 с СД1.

В группе больных СД1, башкир по этнической принадлежности, с большей частотой, чем среди здоровых индивидов, идентифицированы аллель DQB1*0302 (Р’=0,025) и генотип DQB1*0201/*0501 (P’=0,012). Данный факт позволяет считать их маркерами повышенного риска заболевания (OR=2,56, OR=5,86 соответственно). Аллели DQB1*0301 (P’=0,002) и DQB1*0602-08 (P’=0,001) выявляются в группе больных реже, чем в группе здоровых лиц и являются маркерами пониженного риска СД1 (OR=0,26, OR=0,06). 

Результаты генотипирования выборки из русских по этнической принадлежности пациентов и здоровых лиц позволили сделать следующее наблюдение. Среди больных СД1 сравнительно со здоровыми лицами выше доля лиц с генотипом DQB1*0201/*0501 (P’=0,001). Высокая статистическая значимость различий позволяет оценить этот генотип как предрасполагающий к заболеванию (OR=3,94). В то же время аллели DQB1*0301 (P’=0,020) и DQB1*0602-08 (P’=0,000, OR=0,05) выявлены в выборке больных с меньшей частотой. Данные аллели можно охарактеризовать как маркеры пониженного риска СД1, причем относительные шансы заболевания на порядок ниже для носителей аллеля DQB1*0602-08 (OR=0,04), чем для носителей аллеля DQB1*0301 (OR=0,43). 

Согласно результатам проведенного исследования, среди больных СД1, татар по этнической принадлежности, выше, чем среди здоровых лиц, частота аллеля DQB1*0302 (P’<0,001); этот аллель, таким образом, можно отнести к предрасполагающим к заболеванию (OR=4,04). В выборке больных реже, чем в выборке здоровых лиц, выявляются аллели DQB1*0301 (P’=0,001) и DQB1*0602-08 (P’<0,001). Показатели соотношения шансов по данным аллелям позволяют расценивать их как протективные (OR=0,25, OR=0,11 соответственно). 

На основании результатов целого ряда исследований показано, что разные аллели гена DQB1 кодируют различные аминокислотные остатки в 57-м положении β-цепи молекулы HLA DQ, которая связывает и представляет антигены лимфоцитам. Те молекулы DQ, которые не имеют в 57-м положении β-цепи аспарагин, обладают низким сродством к аутоантигенам островковых клеток, что приводит к нарушению выработки иммунологичес­кой толерантности в процессе обучения Т-лимфоцитов в тимусе, а в последующем – к развитию аутоагрессии против β-клеток. Необходимо отметить, что у башкир, русских и татар выявлены аллели повышенного риска СД1 (DQB1*0302, DQB1*0501), которые также не кодируют остаток аспарагина в 57-м положении β-цепи молекулы DQ. Обращает на себя внимание тот факт, что по результатам ассоциативного исследования у башкир, русских и татар Башкортостана, аллелями и генотипами повышенного (DRB1*04, DRB1*17, DRB1*04/*17, DQB1*0302, DQB1*0501, DQB1*0201/*0501) и пониженного риска (DRB1*15, DRB1*11, DRB1*01, DQB1*0301, DQB1*0602-08) СД1 являются те же самые аллели и генотипы генов HLA класса II DRB1 и DQB1, что и в других популяциях европеоидного, монголоидного и смешанного европеоидно-монголоидного происхождения. Согласно данным нашей работы, наибольший риск СД1 во всех этнических группах взаимосвязан с генотипом DRB1*04/*17. Во многих исследованиях СД1 среди европейцев риск заболевания также выше у DR3/DR4 гетерозигот, чем у гомозигот DR3/DR3 и DR4/DR4 DR4 [16]. Поэтому представляло интерес выделение среди обследуемых лиц группы с генотипом DRB1*04/*17 и анализ ассоциаций аллельных вариантов гена DQB1 в выборке с отличными от DRB1*04/*17 генотипами. Результаты данного анализа представлены в таблице 1.

Обнаружено, что при стратификации обследуемых лиц в зависимости от наличия или отсутствия генотипа DRB1*04/*17, ассоциация с заболеванием аллеля DQB1*0302 в этнической группе башкир нивелируется. Так, среди DRB1*04/*17-негативных пациентов частота лиц, имеющих аллель DQB1*0302, составила 35,2% против 20,0% у DRB1*04/*17-негативных здоровых лиц (Р=0,071). Различия по частоте встречаемости генотипа DQB1*0201/*0501 в этой же этнической группе среди больных и здоровых DRB1*04/*17-отрицательных лиц также не являются статистически достоверными (18,9% и 7,5% соответственно; Р=0,062).

Среди русских значимость генотипа DQB1*0201/*0501 как маркера СД1 тоже утрачивается в отсутствие генотипа DRB1*04/*17. Так, доля лиц с данным генотипом среди DRB1*04/*17-негативных пациентов с СД1 составляет 18,9%, а среди DRB1*04/*17-негативных лиц контрольной группы – 6,7 % (Р=0,401).

Что касается этнической группы татар, то различия по частотам DRB1*04/*17-отрицательных лиц, имеющих аллель DQB1*0302, среди больных СД1 (36,4%) и здоровых лиц (18,6%) остаются статистически значимыми (Р=0,011) даже после введения поправки Бонферрони на число сравниваемых групп (Р’=0,044). 

Была проведена стратификация обследованных в зависимости от наличия или отсутствия предрасполагающих маркеров локуса DQB1 и проведен анализ ассоциаций генотипа DRB1*04/*17 с СД1 в группах лиц, негативных по DQB1-маркерам (табл. 2). Полученные результаты свидетельствуют, что генотип DRB1*04/*17 является независимым от DQB1 фактором предрасположенности к СД1. Так, в группе DQB1*0302-негативных башкир генотип DRB1*04/*17 встречается с частотой 15,5% среди больных СД1 и не встречается среди здоровых (Р’=0,006, OR=25,5), в группе DQB1*0302-негативных татар – с частотой 14,3% и 1,3% соответственно (Р’=0,021, OR=12,7). А лица без генотипа DQB1*0201/*0501, башкиры по этнической принадлежности, в 22,2% случаев имеют генотип DRB1*04/*17 в группе пациентов против 2,6% в группе контроля (Р’=0,002, OR=10,9), что можно сказать и о русских (18,8% и 3,5% соответственно, Р’=0,017, OR=6,4).

Осуществлен анализ ассоциаций сочетаний генотипа DRB1*04/*17 и «протективных» маркеров по аллельным вариантам гена DQB1 с СД1 (табл. 3). В результате показано, что присутствие в DRB1*04/*17-позитивном генотипе протективных DQ-маркеров нивелирует риск заболевания. Частота этих сочетаний среди больных в этнической группе башкир составляет 1,4%, среди здоровых они не идентифицированы (Р=0,457). В этничес­кой группе русских сочетание генотипа DRB1*04/*17 с аллелями DQB1*0301 и DQB1*0602-08 составляет 0% и 1,1% соответственно в когорте больных СД1 и 1,1% и 0% в когорте здоровых (Р=1,000 и 0,497 соответственно). У татар доля лиц с сочетанием DRB1*04/*17-DQB1*0301 составила 1,9% в выборке больных и 0% среди здоровых (Р=0,502), а с сочетанием DRB1*04/*17-DQB1*0602-08 – 0% и 1,1% соответственно. Таким образом, данные сочетания практически не встречаются ни среди здоровых лиц, ни среди больных СД1. Вероятно, это свидетельствует об отсутствии сцепления между аллелями DRB1*04, DRB1*17 и DQB1*0301, DQB1*0602-08.

Поскольку в этнической группе татар аллель DQB1*0302 является независимым от DRB1*04/*17 фактором риска СД1, то был проведен анализ его сочетаний с протективными маркерами по аллельным вариантам гена DRB1 (табл. 4). Данные сочетания являются довольно редкими. Так, аллель DQB1*0302 совместно с аллелем DRB1*15 не выявлен ни у одного лица с СД1 и только у одного человека из группы контроля (Р=0,451). Различия по частоте сочетания аллеля DQB1*0302 с аллелем DRB1*01 не являются статистически достоверными (5,6% в контрольной группе и 1,9% в группе пациентов, Р=0,412). Протективные аллели DRB1 нейтрализуют предрасполагающий эффект полиморфизма гена DQB1.

В таблице 4 представлены все генетические маркеры СД1 по генам HLA-DRB1 и HLA-DQB1 в популяциях народов Республики Башкортостан.

Выводы

СД1 ассоциирован с аллельными вариантами гена HLA класса II DRB1 у жителей Республики Башкортостан, башкир, русских и татар по этнической принадлежности. Общими для этих этнических групп маркерами повышенного риска заболевания являются аллели DRB1*04, DRB1*17 и генотип DRB1*04/*17, маркером пониженного риска – аллель DRB1*15. Кроме того, пониженный риск заболевания у русских предопределяет аллель DRB1*11, у татар – DRB1*01. 

Полиморфизм гена DQB1 вносит вклад в риск развития СД1. При этом риск СД1 определяется комбинацией аллелей генов DRB1 и DQB1. Предрасположенность по DQB1-аллелям у русских и башкир реализуется лишь при наличии генотипа DRB1*04/*17, только у татар аллель DQB1*0302 маркирует повышенный риск заболевания независимо от DRB1-генотипа. Напротив, генотип DRB1*04/*17 является независимым от DQB1 фактором предрасположенности к СД1 во всех рассмотренных этнических группах. 

Маркерами пониженного риска СД1, общими для трех этнических групп, являются аллели DQB1*0301, DQB1*0602-08. Их наличие даже в DRB1*04/*17-генотипе нивелирует риск заболевания во всех популяционных группах. 

Конфликтов интересов, связанных с рукописью, нет.